کامپیوتر - کشاورزی چی می خوای بگو ؟

                     یماری تیلریوز Theileriosis

بیماری تیلریوز یکی از معضل های مهم پیشرفت در صنعت دامداری در اکثر نقاط جهان می‌باشد . انگلهای تیلریا ‏T. annulata و T. parva مهمترین گونه های اقتصادی و مسئول تلفات و کاهش تولید تخمین زده شده اند.

استراتژی مراقبت از بیماری تیلریوز در بیشتر کشورها بوسیله کنترل ناقلین بخصوص کنه ها می‌باشد. اما کنترل کنه ها نسبت به روش‌های دیگر کنترل این بیماری از اهمیت کمتری برخوردار می‌باشد زیرا اولا کنه کش ها ( سموم Acaricide ) گران تمام میشوند و ثانیا مقاومت بر علیه اکثر آنها ایجاد شده است. در ضمن مدیریت حمل ونقل و قرنطینه دام بطور جدی قابل اجرا نمی باشد. از دیگر روش‌های کنترل بیماری استفاده گسترده از واکسیناسیون می‌باشد. درمان داروئی معمولا با Parvaquone, Buparvaquone, Halofuginone, برای هر دو گونه ‍T. parva, T. annulata موثر می‌باشد. اما این درمان‌ها دام مبتلا را مبرا از آلودگی Sterilise نمی‌کنند.

● واکسن‌های مورد لزوم :

برای تهیه واکسن برای T. annulataاز تیره سلولی شیزونت Schizont-infected cell lines استفاده می‌شود. این واکسن که حاوی سلول‌های شیزونتی می‌باشد باید تا کمی قبل از مصرف در دمای انجماد نگهداری شود.

برای واکسینه کردن دام‌ها بر علیه T. parvaاز روش آلوده کردن و درمان استفاده می‌شود. بصورتیکه مقداری کنه آلوده جمع آوری شده از روی بستر را چرخ کرده و عصاره آنرا زیر پوستی تزریق می‌کنند و بلا فاصله بطور همزمان درمان با تتراسیکلین را شروع می‌کنند. معمولا یک عفونت خفیف یا پنهان ایجاد می‌شود که با پاسخ ایمنی کنترل می‌شود.

● تشخیص بیماری و مشخصات انگل :

تشخیص بیماری وابسته به علائم کلینیکی، شناختی از شدت بیماری و گستردگی ناقلین یا کنه ها و بررسی لامهای تهیه شده ( گسترش خون و یا گسترش غدد لنفاوی ) می‌باشد. غیر از فرم‌های مختلف داخل گویچه قرمزی در گسترش‌های خونی، شیزونت مشخصه مهم و خوبی در آلودگی با گونه های ‏T. parvaو T. annulata درگسترش‌های تهیه شده از غدد لنفاوی می‌باشد. سلول‌های آلوده ممکن است در گسترش‌های فشاری Impression smears تمام بافت‌ها دیده شوند.

● بیماری زایی

شیزونت گونه T. parva ابتدا در مرحله پاتوژنیک باعث افزایش سلول‌های سیستم لنفاوی Lymphoproliferative شده و بعد از آن باعث تخریب سلول‌های فوق Lymphodestructive می‌شود. حیوان مبتلا دارای علائم تورم غدد لنفی، تب، مقداری افزایش تنفس، تنگی نفس و گاهی اسهال می‌باشد. ضایعات بعد از مرگ شامل تورم و پرخونی غدد لنفاوی، ذات الریه بینابینی Interstitial pneumonia و ادم مابین لبی interlobular oedema ، ضایعات تخریشی erosion , ulcer در شیردان و التهاب روده بهمراه نکروز غدد پیرزpeyer´s patches و در حالتهای طولانی تر نفوذ سلول‌های لنفاوی lymphocytic infiltration به کلیه ها که شبیه سکته کلیوی infarct بنظر آمده و یا بهمراه ترمبوز و ischaemic necrosis می‌باشد. در حیوانات بهبود یافته گاهی در اثر عود بیماری سندرم عصبی چرخش Turning sickness دیده می شود.

خصوصیات بیماری زایی در اثر شیزونت T. annulataتقریبا شبیه ‍T. parvaمی باشد ولی مرحله پیروپلاسمی ممکن است پاتوژنیک تر بوده و باعث کم خونی و زردی شود.

● تکنیکهای تشخیصی :

تیلریا انگل تک یاخته أی اجباری داخل سلولی تمام خانواده گاوهای وحشی و اهلی ( Bovidae ) در جهان می‌باشد. و بعضی از گونه ها نشخوارکنندگان کوچک را نیز مبتلا می نماید. بوسیله کنه های خانواده Ixodidae منتقل میشوند و دارای زندگی پیچیده ای در مهره‌داران و بی مهره ها می‌باشند. شش گونه تیلریا گاو را آلوده می‌کند که دو تا از آنها بیماری زایی بیشتری دارند : اولی بنامT. parvaکه بیماری East coast fever , Corridor disease , Zimbabwean theileriosis را ایجاد و دومی T. annulataباعث بیماری Tropical theileriosis می‌شود.

دیگر گونه ها که شامل T. sergenti, T. buffeli, T. orientalis, T. taurotragi, T. mutansهستند معمولا بیماری زایی خفیفی ایجاد می‌کنند. گونه T. velifera غیر بیماری زا است. اغلب این گونه ها پس آلوده کردن دام ایجاد دام ناقل در دام‌های بهبود یافته را می‌نمایند اما هیچ نوع داده و آماری در رابطه با رل این ناقلین در انتقال بیماری در حالت طبیعی وجود ندارد.

گاوهای بومی درمناطق بومی آلوده ممکن است بیماری را تحمل نموده و یا به بیماری خفیف و تحت کلینیکی مبتلا شوند. اما گاوهای غیر بومی حسا س بوده و در صورت ابتلا علائم شدیدی نشان داده و یا تلف می شوند.

همانطوریکه قبلا هم گفته شد شیزونت ها در گسترش تهیه شده از غدد لنفاوی مشخصه خوبی برای آلودگی با T. parva, T. annulata می‌باشد. شیزونت گونه T. taurotragi در گسترش رنگ آمیزی شده بوسیله گیمسا بخوبی قابل تشخیص نمی‌باشد.

شیزونت T.mutans نسبت به شیزونت T. parva دارای هسته های بزرگتر، مسطح وبی قاعده می‌باشد.

فرم پیروپلاسمی T. parva , T. annulata و T. mutans شبیه بهم می‌باشد. اما معمولا T. annulata , T. mutans بزرگتر و اغلب در حال تقسیم دیده می‌شود. T. velifera ممکن است بوسیله یک پرده حجاب مانند تشخیص داده شود.

● تشخیص سرولوژیکی :

تشخیص وجود پادتن بصورت غیر مستقیم بوسیله (IFA ( indirect fluorescent antibody

بطور گسترده برای تشخیص گونه های مختلف تیلریا بکار می رود. تشخیص نوع آلودگی بخصوص آلودگی با ‍T. parvaچندان در بین روش‌های ایمنولوژی قابل تمایز نمی باشد. بهترین روش سرولوژی قابل تمایز مابین گونه های تیلریا آزمایش غیر مستقیم پادتن فلورسانس (IFA (Indirect Fluorescent Antibody می باشد. در این آزمایش هر دو مرحله شیزونت و پیروپلاسمی بوسیله لام تهیه شده و یا در محلول قابل بررسی می‌باشند. برای نگهداری محلول یا لامهای تهیه شده در مرحله شیزونتی دمای انجماد (۲۰- تا ۷۰- ) استفاده می‌شود ولی در مرحله پیروپلاسمی برای نگهداری محلول از دمای ۴ درجه یخچال و برای لامها از دمای انجماد می‌توان استفاده کرد.

سرم‌های مورد آزمایش را با ماده bovine lymphocyte lysate رقیق می‌کنند و با محلول آنتی ژنی در انکوباتور میگذارند و بعد ضد ایمنوگلوبولین متصل گاوی anti-bovine immunoglubolin conjugate افزوده می‌شود.

الف) تهیه لام یا اسلاید آنتی ژن شیزونت

آنتی ژن مورد استفاده برای schizont IFA test ازتیره سلولی شیزونت لیمفوبلاستوئید Lymphoblastoid گرفته می‌شود. کشتهای سلولی را که دارای رقت ۲۰۰ میلی لیتر شیزونت در یک لیتر شیزونت های آلوده ( به T. parva ویا T. annulata بوده و حاوی ده میلیون سلول در هر میلی لیتر و حداقل ۹۰% سلولها آلوده می‌باشند ) باشد را سانتریفیوژ کرده ( بمدت ۲۰ دقیقه در سرعت ۲۰۰ دور در دقیقه در دمای ۴ درجه ) و مایع روئی را دور ریخته و سلول‌های ته نشین شده را با ۱۰۰ میلی لیتر بافر ( Phosphate buffered saline) PBS در دمای ۴ درجه و pH ۷.۲ تا ۷.۴ مخلوط و دوباره سانتریفیوژ میکنیم. این روش شستشو را سه بار تکرار کرده و در آخرین با رسلول‌های ته نشین شده را با ۱۰۰ میلی لیتر PBS مخلوط کرده تا غلظت نهائی حدودCELL/ML ۷ ۱۰ درآید.

گسترش نازک از محلول سلولی را روی اسلاید حفره دار ( از جنس تفلن )‌تهیه کرده ویا روی لام معمولی را با استفاده از لاک ناخن تقسیم کنیم . هر گسترش باید دارای ۵۰ تا ۸۰ سلول سالم در هر دید میکروسکوپی Field ‌باشد (‌وقتیکه با بزرگنمایی ۴۰ با روغن Immersion بررسی شود) .بوسیله پی پت ۱۰۰l آنتی ژنها را با مکش یکدفعه روی لام ریخته که پس از توزیع محلول شیزنت یا پیروپلاسم یک لایه Monolayer در هر کدام باقی می ماند. اینکار را برای هر حفره انجام داده تا مایع تمام شود. بااین روش تقریباً‌می توان ۶۰۰لام با کیفیت خوب که حاوی ۶ هزار سلول در هر نقطه آنتی ژن باشد بدست آورد . گسترشها را درمعرض هوا خشک کرده ودراستن بمدت ده دقیقه ثابت کرده (‌Fixation)‌ وبطور جداگانه دردستمال کاغذی پیچیده و سپس در کاغذ آلومینیم (‌فویل آلومینیم ‌) ‌وبعد در محفظه ضد آب و هوا دردمای۲۰- درجه سانتیگرادیا ۷۰ - درجه سانتیگراد نگه می داریم . دردمای –۲۰ درجه سانتیگراد بمدت یکسال قابل استفاده هستند ودردرمای –۷۰ درجه سانتیگراد بمدت طولانی تر (‌دردمای یخچال ۴ درجه سانتیگراد بمدت چهارماه قابل نگهداری هستند).

ب) محلول آنتی ژن شیزونت

ابتدا ۵۰۰ میلی لیتر از محلول T.annalataیا T. parva سلول‌های آلوده با غلظت ۱۰ ۶cell/ml سلول سانترفیوژکرده (‌در ۱۵۰ g دور دردقیقه برای ده دقیقه در دمای ۴ درجه )‌ وسلول‌های ته نشین شده در۱۰۰سی سیPBS سرد دوبار شستشو می دهیم.

قابلیت زنده بودن سلولها را بوسیله اوزین Eosin یا Trypan blue بررسی می‌شود (‌که باید بیش از %۹۰‌باشد )‌محلول سلولها باید درمحلول سرم فیریولوژی سرد رقیق شود تا غلظت ۷ ۱۰سلول (/ml Cell) بدست آید دراین حجم ، ‌دوبرابرآن را محلول سرد شده حاوی ۸۰%‌ استن و ۰.۱ % فرمالین در PBS قطره قطره اضافه کرده (‌در درمای –۲۰ درجه )‌تا درمدت ۲۴ ساعت به تثبیت رسد.

سلول‌های ثابت شده را سه بار شستشو داده (‌در سرم فیولوژی سرد شده دردمای ۴ درجه ) و‌در ۲۰۰ دور دردقیقه بمدت ۲۰ دقیقه سانترفیوژ میکنیم. بعد از آخرین شتشو سلول‌های ته نشین شده را در سرم فیولوژی رقیق کرده تا غلظت ۱۰۷/ml بدست آید . بمیزان ۵/۰ سی سی سلول‌های ثابت شده را جدا جدا برداشت و تقسیم می کنیم .

● تهیه اسلاید حاوی آنتی ژن پیروپلاسم:

مرحله پیرپلاسمی گونه های تیلریا را نمی توان درکشت سلول نگهداری یا تهیه نمایند. زیرا آنتی ژن پیروپلاسمی باید از حیوانات زنده آلوده تهیه شود و عفونتهای تجربی بوسیله تزریق زیر پوستی با اسپروزئیت یا کنه های آلوده باT.parva T.taurotragi ,T.annulata , صورت میگیرد. آلودگی گروه انگلی T.sergenti/ T.buffeli/ T.orientalis ,T.mutans or T.velifera بوسیله تزریق داخل رگی خون حیوان ناقل به گاو یا گوساله طحال برداشته و یا تماس با کنه آلوده ایجاد می شود. وقتیکه آلودگی پیروپلاسمی بیش از ۵% ‌باشد، صد میلی لیتر خون آلوده آغشته با مواد ضد انعقاد را بخوبی با PBS مخلوط می کنیم . این مخلوط را سانترفیوژ کرده (‌با۵۰۰دور در دقیقه برای ده دقیقه)‌ و بعدپلاسما و Buffy Coat را جدا کرده و RBC های باقی مانده را بادولیتر PBS رقیق می کنیم. سپس دوباره سانترفیوژ کرده وهمینطور Buffy coat را جدا میکنیم . این عمل رابرای چهار بار تکرار می کنیم و بعد از پنجمین ششتشو، مقداری از RBC های جمع شده Packed RBC را با PBS مخلوط کرده واز آن ۵�۹۵۶;l روی هر اسلاید می گذاریم. نقاط خشک شده را با متانول تثبیت کرده وبا رنگ آمیزی گیمسا رنگ میکنیم ونهایتا زیرمیکروسکوپ نوری بررسی می کنیم . تقریبا ده هزار اسلاید آنتی ژنی (‌صد هزار نقاط آنتی ژن ) ا ز۱۰۰سی سی خون آلوده‌ تهیه می شود. اسمیرهای آنتی ژنی را در دمای اتاق خشک کرده وبعد در دمای ۴ سانتیگراد درجه در استن بمدت ده دقیقه فیکس میکنیم. اسمیرهای فیکس شده شبیه اسلایدهای آنتی ژنی شیزونت نگهداری میشوند.

● محلول یا سوسپانسیون حاوی پیروپلاسم :‌

یک روش تهیه آنتی ژن برای T.parva قبلاً‌شرح داده شد دراین روش صد میلی لیتر از خون حیوانیکه شدیداً‌ در مرحله آلودگی پیروپلاسمی باشد گرفته و مانند آنچه شرح داده شد،گلبولهای قرمز تجمع کرده را به PBS اضافه کرده تا محلول ۵%‌ بدست آید.- در مراحل فوق باید آنتی ژن را استانداردکرد-

تهیه lysate‌Bovine Lymphocyte : این ماده طبق روش Godderis et al. برای بررسی محلول آنتی ژن T. parva بکار می رود . ابتدا یک گوساله سه ماهه که طحال آنرا برداشته اند را درنظر گرفته و واز طریق تماس با کنه و یا پشه تسه تسهtseTse آلوده می کنیم وروزانه بمدت چهارهفته با رنگ آمیزی گیمسا بررسی میکنیم . نهایتا بعد از مرگ یا کشتن حیوان از تیموس و غددلنفاوی نمونه برداری می کنیم .

بافت‌ها را به قطعات کوچکتر تقسیم کرده ودر PBS سرد ( در دمای ۴ درجه) بهمراه %۴۵ /.۰ مواد ضد انعقاد نگهداری میکنیم . سلولها را از بافت بوسیله پارچه MUSLIN جدا کرده و سه بارشتشو با مخلوط PBS-EDTA میدهیم و در دور ۲۰۰ بمدت ۲۰ دقیقه در دمای ۴ درجه سانتریفیوژ میکنیم . لینفوسیتهای شسته شده را با PBS که عاری از EDTA باشد، مخلوط می کنیم تا غلظت نهائی CELL/ML ۱۰۷*۵ بدست آید .

● روش کار برای تشخیص آنتی بادی فلورسانس :‌

اسلاید شیزونت یا پیروپلاسم را از دمای انجماد، ۲۰- درجه سانتیگراد در آورده و بمدت ۳۰ دقیقه در دمای یخچال، ۴ درجه گذاشته و سپس ۳۰ دقیقه دیگر در دمای اتاق میگذاریم.

بوسیله پی پت پاستور ۱۰۰/ آنتی ژن را روی هر لام ریخته ودردمای اتاق ۳۷ درجه خشک می کنیم . می‌توان برای تلعلع بهتر ودید بهتر از Evansblue نیزبهمراه رنگ فلورسانس استفاده کرد و بعد در گلسیرول ۵۰% در pH ۸ میگذاریم تا رنگ Fluorescein isothiocyanate بمدت طولانی تر و عمیق تر اثر گذارد . اسلایدهای تهیه شده تا ۷۲ ساعت در دمای ۴ درجه د رتاریکی قابل نگهداری و استفاده می‌باشند. بدنبال عفونت با اسپروزئیت ها آنتی بادی های تولید شده بر علیه T.parva و T.annulate ابتدا" بین روزهای دهم تا ۱۴ برعلیه شیزونت ودر بین روزهای ۱۵-۲۱ بر علیه پیروپلاسم قابل تشخیص می‌باشند. پادتن‌ها بعد از بهبودی ناپدید می شوند ووابسته به فاکتورهای متفاوتی از جمله وضعیت ناقل، ‌فاصله مابین درمان، درمعرض قرار گرفتن و تماس دوباره با کنه آلوده تغییر می کنند. معمولاً ‌۴ تا ۶ ماه بعد از آلودگی آنتی بادی پائین می آید (‌در صورتیکه تماس دوباره پیش نیاید).

بدنبال آلودگی با T.mutans آنتی بادی در روزهای دهم تا ۱۵ قابل اندازه گیری بوده و بعد از ۱۲-۲۴ ماه پائین می‌آید.

ب)‌ نیازمندیهای لازم جهت تهیه واکسن‌ها و تشخیص‏های بیولوژیک

۱) واکسن‌های کشت سلولی برای تیلریا آنولاتا:‌

از اوائل قرن بیستم که عامل بیماری تیلریا شناخته شد مایه‏کوبی برعلیه بیماری تیلریا مورد نظر قرار گرفت . گرچه یک واکسن زنده با قدرت ایمنی زائی شناخته شده اخیراً‌به تولید رسیده است چیزی که بیشتر تا حالا مورد استفاده قرار گرفته کشت سلولی شیزونت تغیرحدت یافته است . برای مقابله با تیلریا آنولاتا نحوه تولید و تست‏های ارزشیابی قبلاً ‌تشریع شده است . این نوع واکسن بصورت گسترده‏ای در کشورهای ایران ،‌ترکیه ،‌هندوستان و روسیه و چین مورد استفاده قرار گرفته است.

● مدیریت تهیه بذر واکسن:‌

▪ خصوصیات بذر واکسن: ‌سلول‌های آلوده به تیلریا آنولاتا که بعنوان کشت اولیه مورد استفاده قرار میگیرد از گره های لنفاوی ‌کبد،‌ طحال، که به روش اسپتیکال از دام آلوده یا مرده جدا می‌گردد.

▪ روش کشت :‌ سلول‌های آلوده در مرحله اول در محیط(Minimun Essential Medium)MEM که حاوی ۲۰ درصد سرم گوساله و پنی‌سیلین (۱۰۰میکروگرم در هرCC ) واسترپتوماسین ۵۰ میکروگرم در CC ومایکوستین ۷۵ میکروگرم درCC در ظروف درب‏دار پلاستیکی مخصوص کشت وارد می‌شود . محیط کشت یا بصورت لایه تک ردیفی Monolayerویا بصورت مایعSuspension استفاده می‌گردد.

▪ سلامتی(Safty):‌ شیزونت تیلریا آنولاتا با پاساژهای مکرر درمحیط کشت تخفیف حدت می یابد . مکانیزم تخفیف حدت یافتن نامعلوم است ولی بنظر میرسد تعداد تقسیمات سلولی مهمتر از مدت زمان و تعداد پاساژ در محیط کشت می‌باشد و تیلریا جدا شده از فیلتر نیازمند پاساژ بمدت ۴ الی ۳۰ ماه می‌باشد تا کاملاً ‌از حدت آن کاسته شود و نیز این زنجیره وقتی کامل می‌شود که بعد از هر ۲۰ الی ۳۰ پاساژ به گوساله های حساس تزریق شود . تخفیف حدت وقتی کامل می‌شود که محیط کشت در تزریق به دام حساس باعث بوجود آمدن تب و یا اجرام داخل سلولی قابل رؤیت مثل شیوزنت یا‌رینگ تیلریا نشود.

دام‌هائیکه دارای عفونت باشند بخصوص عفونت‏های ویروسی ممکن است بخوبی به واکسن واکنش نشان ندهند . مایه‏‏کوبی دام‌ها پس از مایه کوبی با واکسن تیلریا ویا همزمان با آن بدون درنظر گرفتن فاصله زمان مناسب توصیه نمی‌شود بخصوص واکسن‌های ویروسی از قبیل واکسن تب برفکی زیرا احتمال تداخل در ایجاد ایمنی برای هردو واکسن وجود دارد.

درایران معمولاً‌مایه‏کوبی دام‌های که بیش از ۵ ماه آبستنی دارند توصیه نمی‌شود در صورتیکه در مطالعاتی که دراسرائیل انجام شده اثری بر روی آبستنی نداشته است .

بطورکلی دام‌ها می‌بایست در چند ماه اول زندگی مایه‏کوبی شوند و بادزراپلی که توسط گزش کنه‏های آلوده دریافت می‌کند میزان ایمنی در سطح بالای باقی خواهد ماند.

● واکسیناسیون دام‌ها برعلیه تیلریا پاروا

دراین روش مایه‏کوبی از روش آلودگی ودرمان‌(‌Infection&Treatment ) استفاده می‌گردد . این متد براساس آلودگی دام‌ها با کنه‏های آلوده تخفیف حدت نیافته می‌باشد که دارای شیوزنت تیلریا می‌باشند وپس از آلودگی این حیوانات را با تتراسیکلین درمان می‌کنند . تتراسیکلین باعث کم شدن حدت آلودگی می‌شود که در نتیجه آلودگی خفیف که با درگیر شدن سیستم ایمنی بدن دام قابل کنترل می‌باشد .حاصل می‌شود که این مرحله را بنام Carrier یا ناقل نام میگذارند احتیاط لازم برای جلوگیری از شیوع بیماری و یا وارد شدن تیلریا به ناحیه‏های جدید وپاک امری لازم و ضروری است .

● رعایت اصول ایمنی :

‌توصیه ‏های ایمنی ذیل در تهیه و نگهداری و حمل تیلریا پاروا لازم وضروری است .

▪ تهیه کنه‏ها از فیلد: ‌آگاهی‌های لازم در مورد احتمال آلودگی انسان به عوامل مختلف بیماری زا در حین جمع آوری کنه‏ها بایستی به اطلاع اشخاص درگیر کار رسانده شود . مهمترین عامل بیماری زا در حین جمع آوری کنه ها در فیلد که تاکنون شناخته شده‏اند شامل تب کریمه کنگو می‌باشد که معمولاً‌همراه کنه ‏های جنس هیالوما و بصورت گسترده در مناطقی که جنس‏های مختلف کنه Rhipicephalus وجود دارد همراه می‌باشد . بنابراین کسانیکه در جمع آوری کنه‏ها فعالیت می کنند می‌بایست کاملاً‌از وضعیت بیماری مطلع باشند .

● استراتژی واکسیناسیون :‌

بر عکس تیلریا آنولاتا که در میان سویه های مختلف آن یک ایمنی عمومی وجود دارد در تیلریا پاروا مسائل پیچیده‏تری وجود دارد . معمولا دو راهکار برای حل این مشکل وجود دارد . یکی استفاده از مجموع سه استوک که از قویترین طیف‏های بومی چندین کشور تهیه شده است می‌باشد ،‌ این واکسن در کشور مالوی تحت نظر FAO ودر شرایط کاملاً‌ استریل تهیه شده است . اگر این واکسن درمنطقه یا کشوری بتواند جواب دهد باید از راهکار دوم که عبارتست از تهیه وجدا سازی شیوزنت محلی که یا با اضافه کردن به واکسن مرحله اول ویا به تنهائی مورد استفاده قرار میگیرد استفاده کرد استراتژی مرحله دوم هم از نظر قیمت تمام شده وهم از نظر زمان گران تر و طولانی‏تر است، ‌بطوریکه ایمنی زائی از طریق آلودگی و درمان موثر است ولی مسائلی از قبیل حمل ونگهداری کنه‏ها وریسک بخطر افتادن مناطق پاک و خطر ناقلین همگی باعث شده که در فکر شناخت یک آنتی ژن مناسب برای تولید یک واکسن خوب بود.

اقتباس از دستورالعمل OIE (Office International des Epizooties) اکتبر ۲۰۰۱ Chapter ۳.۲.۱۱ .